السلام عليكم ورحمه الله وبركاته
محاضره اليوم محاضره مهمه جدا وهي ( كيفيه صناعه recombinant vaccine ) .
اللقاحات المحمله اختراع جيل جديد من اللقاحات اثبت نجاحه وهو طفره في عالم وعلم اللقاحات ، والتي كان اعتماد العلماء على اللقاحات التقليديه .
تتم صناعه هذه اللقاحات في مرحلتين مهمتين هنا :-
١- بواسطه برنامج software في الكمبيوتر .
٢- استخدام الانزيمات في المختبر .
اعتقد ان الكثير سوف يسالون كيف يتم التصنيع في الحاسبه بواسطه جهاز ، وهل هذا الكلام صحيح ، لان الهاله الاعلاميه والتكتم الشديد في صناعه اللقاحات المحمله جعلت معظم الباحثين لا يفكرون او يسالون عن كيفيه صناعه اللقاح باعتبره صناعه صعبه وتحتاج الى كوادر خاصه وذات سريه قصوى . بل هي على العكس لكن تحتاج الى تفكير وعزم في اتخاذ القرارت واي مجموعه من الاطباء الذي يعملون في مجال تصنيع اللقاحات ان يطبقوا التصنيع بشرط ( توفير الدوله للمختبرات وكتات الانزيمات ) والبقيه كلها موجوده ، لكن يجب عليك ان لا تفكر وتبقى تستورد ….. نقطه راس سطر .
الصناعه تتم مثل ما كتبت اعلاه ، يقوم المهندسين والفنيين باستخراج جين كامل حقيقي من مواقع رصينه نشرت فيها ابحاث حقيقيه مثل موقع NCBI او مواقع اخرى . بعدها يقوم الباحثون بتنزيل ملف ال FASTA من الموقع ويستقطع منه جزء بسيط من الجينوم ويتم ادراجه في ال NEB CUTTER وهو برنامج software تستطيع ان تنزله على حاسبتك ، او هو موحود online في عده مواقع تستطيع ان تستخدمه لكنه مراقب .
هذا البرنامج يعطينا المكانات المراد تقطيعها في الجينوم الذي ادخلناه ( اقصد ملف ال FASTA ) ، وكذالك يعطينا نوع الانزيم الذي يقطع هذه القطعه المراد حذفها ، يعني يعطينا القطعه ويعطينا باي انزيم نقطعها ، كل قطعه في اي جينوم معمول له KIT توجد لديها انزيم لقطع هذه القطعه .
مثلا ناخذ فيروس ال ND يوجع الجينوم الكامل الماخوذ من ال NCBI ويوضع في البرنامج ، ثم تامر البرنامج بقطع قطعه ال F protein بعدها سوف يعطينا نوع الانزيم الذي سوف يقوم بقطع هذه القطعه والموجود في Kit خاص ، بعد عمليه القطع سوف يعمل البرنامج sticky ends ومعناها سوف يفصل هذه القطعه من ال DNA .
نهايه القطع المفصولة تكون غير متساويه لكي يسهل عمليه ربطها عند استخدام انزيمات الربط والتي سوف اشرحها لاحقا .
عمليه القطع تكون مثل عمليه قطه عضله الرجل لغرض تطويلها .
نستطيع ان ناخذ اكثر من قطعه ليس فقط ال F protein يمكن ايضا ان ناخذ HN protein وال V protein وهكذا ، وكل قطعه لها انزيم للقطع وانزيم للربط .
كل هذه الامور يقوم بيها المهندسون وبعض من العلماء الذين يعملون في مجال تصنيع اللقاحات . كل هذا حبر على ورق ، فقط حاسبه وبرنامج وورقه وقلم ، وتسجيل كافه البينات منها القطع وانزيمات القطع وانزيمات الربط ، والى هنا تنتهي العمليه الاولى .
العمليه الثانيه في المختبر يتبع
الحمد لله كثيرا على ما نعلمه وعلى ما نعلمه .
الدكتور
ميلاد ابراهيم عريبي
١٢-٩-٢٠٢٣
تكمله للمحاضره الاولى .
بعد الانتهاء من العمليات البرمجيه داخل الحاسوب ، ننتقل الان الى الشق الثاني وهو الشق المختبري .
يوجد نوعان من الانزيمات :-
١- انزيمات القطع restrictions enzymes والتي تقوم ب DNA cutting.
٢- انزيمات الربط ligase enzymes والتي سوف تقوم بربط او لحام الاطراف المقطوعه في ال DNA المقطوع .
عمل الانزيمات القاطعه هو DNA fragments with a known sequence at each end ، اما عمل انزيمات الربط هو that brings about the binding or joining of two molecules .
داخل المختبر ، نقوم بتحضير ال DNA الخاص للضرب المصلي الضاري مثلا لفيروس ال ND عالي الضراوه ، ونقوم بتحضير DNA الخاص بالضرب المصلي ال ND ذو الامراضيه البسيطه مثل ال Lasota .
بعد ذالك نقوم باستيراد Kits خاص فيه الانزيمات القاطعه و Kits خاص في الانزيمات الرابطه ، طبعا هذا تحتاج الى موافقات من الدول التي تصنع هذه المواد .
بعد ذالك نقوم بوضع ال DNA العائد للفيروس الضاري في flask ونضيف عليه انزيمات القطع وحسب ال protocol الشركه المصنعه وهذه الانزيمات سوف تقوم بقطع قطعه ال F protein لوحدها لانها مصممه لهذه القطعه فقط حيث يقوم الانزيم بقطعها وتعليمها ب tag مثلا تستخدم بعض الدول المصنعه ال histidine لتعليم القطع المقطوعه ، وهذه العلميه ليست فقط في تلك الكلمات بل هي ابحاث وكتب وبروتوكولات وعلماء وضعوا بصمتهم بهذه الطريقه من حيث العمليه وصناعه انزيمات القطع .
احتمال تفشل هذه العمليه لاكثر من مره لذالك من الضروري ان يكون هنالك صبر وهمه في هذا العمل وعدم اليأس ويجب ان نكون متفائلين دائما .
بعدها توخذ هذه القطعه ال F protein بعد التعليم ويهمل ال DNA للضرب المصلي العالي الامراضيه .
نفس هذه الطريقه سوف تطبق على ال DNA الماخوذ مثلا من ال Lasota ولكن الانزيم سوف يقوم تعليم ال DNA ولا يعلم القطعه حسب protocol مكتوب لتعليم ال DNA وتهمل القطعه F protein التي قطعت .
الان توجد قطعه F معلمه ماخوذه من DNA ضاري ، ويوجد DNA منزوع قطعه ال F من عتره غير ضاريه .
يوخذ ال F مع ال DNA ويوضع في flask ويوضع عليه الان انزيم الربط او ( اللحام ) .
بعد مرور وقت معين سوف يلتحم ال F protein مع ال DNA حسب توقيت وبروتوكول ال Kits والنتيجه النهائيه الحصول على DNA كامل وجاهز للتكاثر .
عمليه ال replication لل DNA تتم اما عن طريق ال plasmids او عن طريق ال T.C ، بعدها تتم عمليه تنقيه للفيروس الجديد بواسطه تقنيات خاصه وتشخيصه هل هو نفس الفيروس ام حدثت له طفره او اختلف وتتم عن طريق Genetic engineering .
بعد ذالك نقوم بعمل Experimental infections واجراء الاختبارات التي ذكرتها في محاضره سابقه لمعرفه هل فيروس ال ND من الضروب المصليه القويه او المتوسطه ام الضعيفه ، ولذلك لمعرفه مدى دقه العمل .
بعد هذه التجارب ، سوف يتدخل العاملون في مجال ال Vaccinology لاجراء اختباراتهم في تضعيف هذه الضروب المصليه وتصنيع لقاحات محمله تعتمد في عملها على تحفيز الجهاز المناعي بدون اي ضرر يصيبه .
هنالك بعض الملاحظات المهمه .
انزيمات القطع هي انزيمات مستخرجه من بكتريا بدائيه النواه prokaryotes وهذه الانزيمات ترتبط بتسلسلات محدده ومعروفه لا DNA والتي نستطيع ان نطلق عليها متوافقه القطع المقطوعه ، بحيث كل انزيم ماخوذ من بكتريا معينه او دور في قطع قطعه معينه من ال DNA واحده ومستهدفه ولا يقطع اي قطعه اخرى في نفس ال DNA .
انزيمات الربط ligase وهذه الانزيمات هي المسؤوله عن ربط القطع الماخوذه وذات النهايات المتطابقة والمسبق قطعها بانزيمات قاطعه مع ال DNA الاصلي الجاهز للربط بنفس النهايات ، كل انزيم ربط مسوول عن قطعه ربط واحده وغير مسوول عن القطع الباقيه في ال DNA .
انزيمات الربط تستخدم الطاقه ال ATP بحيث تحفز التفاعل بين النهايات المقطوعه بين القطعه وال DNA حيث تعمل على ربط ال Phosphate الملتصق بالاطراف القطعه وال hydroxyl المرتبط بالطرف الاخر ال DNA بحيث تكون سلسله واحده قويه اثناء الربط ( يشبه الصمغ ) وتسمى هذا العمليه sugar phosphate backbone .
بعد كل هذه العمليات تاتي عمليه recombinant plasmid والتي سوف اكتبها في محاضره اخرى في وقت قريب .
اعتقد ان المحاضره فيها صعوبه ولكني اختصرت الكثير فيها لكي لا تتشتت افكار الباحث .
الحمد لله كثيرا على ما نعلمه وعلى ما لا نعلمه .
الدكتور
ميلاد ابراهيم عريبي
١٤-٩-٢٠٢٣